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基于人源Cdc25C蛋白融合表达研究

2013-06-26 14:31 来源:生物医学论文 人参与在线咨询

材料与方法

1.材料:MCF-7细胞由本实验室保存;感受态大肠杆菌DH5α、BL21及质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;DMEM培养基购自GIBCO生物公司;胎牛血清为杭州江滨公司产品;ImPro-II逆转录试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自NEB公司;谷胱甘肽琼脂糖珠4B购自AmershamPharmaciaBiotechnology公司;辣根过氧化物酶标记的GST抗体、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP购自Sigma公司;引物合成和测序由北京奥科生物技术有限公司完成。

2.MCF-7细胞培养及总RNA提取:用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基,于37℃、5%CO2培养箱中培养MCF-7细胞。收集MCF-7细胞,计数,在约5×106细胞中加入350μLRLT裂解液,充分混匀后加入等体积的70%乙醇,混匀并转移至RNA吸附柱中,8000r/min离心15s,弃上清液;加入700μLRW1液,8000r/min离心15s,弃上清液;加入500μLRPE液,8000r/min离心15s,弃上清液,重复1次;将吸附柱转移到一个新的2mL的离心管中,较大转速离心1min后加入30~50μL不含RNase的水,较大转速离心1min后,将RNA洗脱至1.5mL的EP管中。

3.RT-PCR扩增cdc25c基因:采用ImPro-II逆转录试剂盒,取1μgRNA为模板,以oligo(dT)15和随机引物逆转录合成cDNA(反应条件:25℃5min,42℃1h)。70℃、15min灭活反应体系中的逆转录酶和RNase抑制剂。以该cDNA为模板,以正向特异性引物5'-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3'(含BamHⅠ酶切位点)、反向引物5'-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3('含XhoⅠ酶切位点)扩增cdc25c基因序列。将PCR扩增产物及载体pGEX-4T-1分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选阳性克隆进行酶切鉴定。

4.GST-Cdc25C蛋白的诱导表达:将pGEX-GST-Cdc25C质粒转化大肠杆菌感受态BL21,接种至氨苄西林抗性的LB培养基中,37℃、200r/min培养至D600nm为0.6~0.8,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,12℃、200r/min培养6~8h,收获菌体,超声波低温破碎菌体,离心后取上清,加入4×SDS上样缓冲液[200mmol/LTris-HCl(pH6.8),8%SDS,4%溴酚蓝,40%甘油、10%β-巯基乙醇],沸水浴5min,将样品进行SDS-PAGE。

5.GST-Cdc25C蛋白的纯化:在菌体上清中加入谷胱甘肽(GSH)琼脂糖珠4B,4℃旋转孵育2h,1000r/min离心,弃上清,用PBS缓冲液洗3次,备用;分别向结合GST的GSH琼脂糖珠、与GST-Cdc25C结合的GSH琼脂糖珠中加入1×SDS上样缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH6.8),2%SDS,1%溴酚蓝,10%甘油、2.5%β-巯基乙醇],沸水浴5min,离心后取上清进行SDS-PAGE。

6.免疫印迹分析:SDS-PAGE结束后,将胶用半干转膜法转移到PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1h,加入稀释的辣根过氧化物酶标记的GST抗体,室温孵育1h,用PBST洗膜3次,每次5min,较后将含有辣根过氧化物酶底物的ECL滴加到膜上,在暗室中进行X线胶片显影。

7.磷酸酶活性分析:在300μL磷酸酶反应缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH8.0),50mmol/LNaCl,1.0mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,0.1%BSA]中分别加入1μg纯化的GST蛋白和GST-Cdc25C蛋白,随后加入Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP(终浓度150μmol/L),37℃温育,用荧光分光分度计在490nm激发光波长、530nm发射光波长处检测反应产物的荧光强度,荧光强度值的增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。

结果

GST-Cdc25C融合表达质粒的构建:为了获得cdc25c基因,我们首先提取了MCF-7细胞总RNA,用RT-PCR逆转录获得MCF-7cDNA库,并用cdc25c特异性引物从cDNA库中扩增获得cdc25c基因,PCR产物电泳鉴定结果见图1。测序结果表明,该PCR产物序列与cdc25c基因序列(GenBankNo.BC019089)一致。随后,通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点将cdc25c基因的PCR产物克隆至pGEX-4T-1载体上,GST-Cdc25C融合表达阳性克隆双酶切鉴定结果如图1所示。

GST-Cdc25C融合蛋白的表达及纯化:用大肠杆菌BL21感受态细胞表达GST-Cdc25C融合蛋白,诱导表达条件为低温12℃、6~8h。收集菌体,于15mL冰浴的PBST(含蛋白酶抑制剂1片/25mL)中超声波破碎4min,使可溶性GST-Cdc25C融合蛋白释放到上清液中。SDS-PAGE结果表明,与GST对照组相比,在相对分子质量约87×103位置出现了显著条带(图2A),与GST-Cdc25C蛋白的相对分子质量一致,说明GST-Cdc25C在大肠杆菌BL21中获得了可溶性表达。随后,用GSH琼脂糖珠与裂解上清混匀,4℃旋转孵育2h,离心得到纯化的相对分子质量为87×103的GST-Cdc25C融合蛋白,并存在一定程度的降解。免疫印迹实验进一步表明,GST-Cdc25C融合蛋白及GST对照蛋白均获得表达及纯化(图2B)。

GST-Cdc25C的磷酸酶活性分析:以3-OMFP为Cdc25C磷酸酶反应底物,在磷酸酶活性反应体系中分别加入1μgGST和GST-Cdc25C融合表达蛋白,37℃温育,每隔5min用荧光分光分度计检测反应产物的荧光强度,荧光强度增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。用荧光强度值相对时间变化绘图,结果如图3,与GST蛋白相比,加入GST-Cdc25C融合蛋白的反应体系的荧光值显著升高且速率稳定(基本呈线性),说明原核表达的GST-Cdc25C具有显著的稳定的磷酸酶活性。

讨论

在成功钓取人源cdc25c全长基因的基础上,我们表达纯化了具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白。由于GST-Cdc25C在表达过程中容易形成天然二硫键,易导致包涵体的形成,且结构的不稳定增加,因此存在一定程度的降解。Cdc25C在调控细胞周期G2/M转换过程中有重要作用,其磷酸酶活性对于激活Cdc2/周期蛋白B复合体,开启细胞有丝分裂进程至关重要。目前发现的Cdc25C上游调节分子主要通过相互作用及磷酸化或泛素化修饰调节Cdc25C的磷酸酶活性及亚细胞定位,进而影响细胞周期的进程。本研究中,我们表达纯化出具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白,为研究c-Abl酪氨酸激酶通过Cdc25C调控G2/M转换的分子机理提供了基础。(本文图略)

本文作者:张鹏 刘萱 曹诚 单位:北京军事医学科学院 生物工程研究所 

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